För de flesta patienter är analys av 25-hydroxi-Vitamin D bättre lämpad för bedömning av Vitamin D-koncentrationen i kroppen. I undantagsfall skall dock 1,25-dihydroxi-Vitamin D analyseras, så som vid njursjukdom med nedsatt omsättning av 25-hydroxi-Vitamin D till 1,25-dihydroxi-Vitamin D, vid utredning av oklara rubbningar i calcium-, magnesium- och fosfatomsättningen, störningar i bisköldkörteln, Vitamin D-receptordefekt, granulomatösa sjukdomar samt i speciella utredningsfall.
Höga värden av 1,25-dihydroxi-Vitamin D ses vid hyperparatyreoidism och Vitamin D-intoxikation (värden kan dock även vara normala eller låga, varför analys av 1,25-dihydroxi-Vitamin D inte rekommenderas vid misstänkt intoxikation).
Låga värden ses vid Vitamin D-brist, nedsatt njurfunktion (även vid måttlig insufficiens), tumörrelaterad hypercalciemi, höga fosfatvärden, hypoparatyreoidism, nefrotisk syndrom, uttalad leversjukdom med mera.